Оценка видов микроорганизмов, встречающихся в медицинской практике и образующихся биопленки на медицинских катетерах
Ремедиум Приволжье, № 6 (174) 2019
Длительное нахождение большинства пациентов в клинических отделениях связано с высоким риском развития вторичных инфекционных заболеваний, вызываемых условно-патогенной микрофлорой. Значительно чаще они регистрируются у осложненных больных терапевтического и хирургического профилей, что связано с внедрением в повседневную клиническую практику новых высокотехнологических методов лечения, которые требуют увеличения объема инвазивных вмешательств, например, установки имплантатов, внутрисосудистых катетеров, электрокардиостимуляторов, электродов и т. д.
Считается, что большинство инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), вызывают бактерии и грибы, уже присутствующие в организме пациента до инфекции. Кроме того, они же могут стать причиной перекрестной передачи между пациентами и медицинскими работниками.
Так, микроорганизмы, вызывающие катетерассоциированные инфекции, обычно проникают с кожных покровов на месте введения катетера или через наружное отверстие катетера. На сегодняшний день катетерассоциированные инфекции занимают третье место среди всех нозокомиальных инфекций.
В связи с интенсивной антибиотикотерапией, а также с увеличением числа пациентов с иммунодефицитными состояниями растет разнообразие микроорганизмов, вызывающих данные инфекции. Спектр видов часто зависит от профиля отделения и пути инфицирования. Микроорганизмы на поверхности катетера могут образовывать биопленку, которая является не только более резистентной к антимикробным агентам, чем отдельные планктонные клетки, но и способна противостоять иммунным защитным механизмам хозяина.
Формируются биопленочные структуры в результате адгезии, роста и размножения микроорганизмов и образования полисахаридного внеклеточного матрикса. Адгезия микроорганизмов зависит от адгезивной активности самого штамма, присутствия белков макроорганизма в просвете катетера, фенотипических изменений и т. д.
Например, Staphylococcus aureus имеет рецепторы к фибронектину, фибриногену и наламинину, которые часто оседают на внутренней поверхности катетера с током крови, а грибы Candida albicans способны еще и адгезироваться к различным поверхностям, в том числе и к пластику. Целью работы являлось изучение катетер-ассоциированных биопленок пациентов с инфекциями мочевыводящих систем и с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.
Материалы и методы
Нами исследованы образцы катетеров пациентов с заболеваниями мочеполовой системы (11 образцов), предоставленные урологическим отделением, и с заболеваниями сердечно-сосудистой системы (12 образцов), представленные отделением реанимации и интенсивной терапии.
Идентификацию микроорганизмов проводили микроскопическими, биохимическими методами и с помощью биотипирования (MALDI-TOFMS, анализ белкового профиля). В работе использовались селективные хромогенные среды (Bio-Rad) и коммерческие тест-системы, основанные на исследовании ауксанограммы: «Auxacolor 2» (Bio-Rad).
При MALDI-TOFMS анализе значения Score (условное значение, указывающее на точность и качество анализа) выше 2,4 для всех штаммов при успешной интерпретации значений от 2 до 3. Оценку относительных показателей плотности биопленки на поверхности катетеров проводили с помощью метода окрашивания красителем кристаллическим фиолетовым по Ramage et al. (2001).
Методика основана на способности красителя связываться с клетками и компонентами матрикса биопленки и используется как основной метод обнаружения биопленок на различных поверхностях in vitro и in vivo. Образец катетера площадью 1 см² промывали три раза стерильным фосфатным буфером, освобождая катетер от планктонной культуры.
Затем добавляли 1 мл водного раствора 1% кристаллического фиолетового и инкубировали 20 мин при 37 °C. После удаления избытка красителя и промывки образцов добавляли 95% этанол в количестве 1 мл, оптическую плотность регистрировали на ридере с вертикальным лучом света с использованием светофильтра 620 нм.
Статистический анализ проводили из расчета соотношения контроля (окрашенная стерильная лунка) и образца. Эффективность образования биопленок оценивали по методу, предложенному Stepanovic et al. (2007), где ODc = OD (негативного контроля) + 3x (стандартное отклонение негативного контроля). Конечное значение оптической плотности исследуемого образца OD рассчитывали как разницу начального значения и ODc: OD = OD (нач) — ODc.
Результаты и их обсуждение
В ходе работы был определен основной спектр микроорганизмов, характерный для каждого типа катетеров. Исследование образцов катетеров пациентов с заболеваниями мочеполовой системы выявило наличие биопленок у 65% исследованных образцов. Основными представителями микробного пейзажа внутренней поверхности катетера являлись бактерии: Klebsiella oxytoca и Enterobacter cloacae.
Тогда как с внешней поверхности катетера основное место занимали следующие штаммы бактерий, относящиеся к условно-патогенным микроорганизмам: Pseudomonas aeruginosa, K. oxytoca, E. cloacae, E. faecalis, Morganella morganii, Escherichia coli, Bacillus subtilis. Микробиологический анализ центральных венозных катетеров показал незначительный спектр микроорганизмов.
Наличие биопленок выявлено у двух образцов. Внутренняя поверхность катетера в двух случаях была колонизирована представителем коагулазонегативных стафилококков — Staphylococcus epidermidis, в одном случае S. aureus и в одном образце помимо бактериальной микрофлоры присутствовали грибы Candida аlbicans (таблица 1).
Тип катетера | Внешняя поверхность катетера | Внутренняя поверхность катетера |
Мочевой катетер | Enterobacter cloacae Enterobacter faecalis Pseudomonas aeruginosa Klebsiella oxytoca Morganella morganii Escherichia coli Bacillus subtilis | Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae |
Центральный венозный катетер | Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Bacillus subtilis | Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Candida аlbicans |
Следует отметить тот факт, что с внутренней и внешней поверхностей мочевых катетеров нами часто обнаруживались ассоциации со значительным количеством условно-патогенных бактерий (с так называемым протеолитическим основным путем метаболизма) — Klebsiella spp., Escherichia coli и т. д.
С центрального венозного катетера в одном случае выявлена ассоциация Staphylococcus aureus и Candida аlbicans. Оценка относительных показателей плотности биопленки на поверхности катетеров, проводимая с помощью метода окрашивания красителем кристаллическим фиолетовым, показала, что для мочевых катетеров в 27% исследованных образцов установлено присутствие биопленок низкой плотности, в 27% — биопленки средней плотности, в 45% — биопленки высокой плотности.
В образцах центральных венозных катетеров биопленки были сформированы с низкой плотностью. Исследование морфологии биопленок мочевого катетера, на поверхности которого было определено наличие плотной биопленки, с помощью сканирующей электронной микроскопии показало наличие плотного неоднородного матрикса на внутренней и внешней поверхности катетера.
Наблюдали палочковидные и кокковидные бактериальные клетки, а также различные включения в составе биопленки, в том числе эритроциты крови, кристаллы солей. Осмотр биопленки с центрального венозного катетера выявил особенности строения микст-биопленки, связанные с присутствием в структуре биопленки совместно с бактериями и грибов C. аlbicans.
Так, пленки отличались плотной структурой, с более развитым гликозидным каркасом, с большим количеством одиночных бактериальных и грибковых клеток, а также наличием сложных конгломератов, состоящих из псевдомицелия грибковых клеток и клеток S. aureus. Что может говорить о более сложной структурной организации.
Выводы
В результате микробиологических исследований выявлены биопленки микроорганизмов во всех исследуемых типах катетеров, как на внешней, так и на внутренней поверхности. Присутствие на поверхностях катетеров широкого спектра условнопатогенных микроорганизмов у иммунодефицитных больных может привести к возникновению вторичных инфекций.
Некоторые авторы отмечают наиболее вероятное проникновение микроорганизмов по наружной поверхности катетера в течение первых десяти суток после установки. Особый интерес представляет дальнейшее изучение обнаруженных микст-ассоциаций микроорганизмов на поверхности катетера и участвующих в формировании общей биопленки, поскольку взаимное влияние участников ассоциаций друг на друга может вызывать повышение вирулентной активности штаммов, в том числе и антибиотикорезистентность, и, как следствие, отягощать клинические проявления заболевания.
Таким образом, огромное значение имеет регулярное тщательное наблюдение за всеми пациентами на предмет инфекционных заболеваний, связанных с оказанием медицинской помощи в медицинском учреждении. Важно выявлять и ограничивать возможные эпидемические заболевания, наблюдая за пациентами из групп риска.
Первоисточник: «Журнал МедиАль», № 2 (22), ноябрь, 2018